|
随着生命科学技术的发展和研究的不断精细化,许多情况下需要对生物组织的不同组分或不同细胞进行分别研究。如何从复杂、不均一的样品中获得期望的均一的、更接近具有生物活性的组分成为实验技术中需要解决的问题之一。激光捕获显微分离技术能快速准确地从复杂组织中分离出均一的组分,从而为后续的研究工作奠定基础。早期的激光显微分离技术是利用高能量紫外激光束切割组织样本,切割时激光直接照射到组织上,产生很高的温度灼烧细胞导致细胞内的生物大分子破坏严重,所以需要获取大量的细胞才能完成下游的分析,而且影响下游分析的准确性。20世纪90年代中后期,由美国国家健康研究院(NIH),国家癌症研究所(NCI),国家健康与发展研究所(NICHD)三家全美最著名的研究机构合作开发的专利近红外激光捕获显微分离(Laser Capture Microdissection, LCM)技术在世界最著名的杂志Science上发表, 能够快速、安全、准确地获得细胞亚群,甚至单个细胞。
1) 安全性:专利近红外激光技术,是国际上公认的细胞分离最温和、最安全的方法,也是国际上唯一认可的对活细胞捕获以及后续成功培养的方法。固态近红外激光采用810nm波长,远离了生物大分子的吸收峰,而且在捕获过程中低能量激光(0-100mW)不直接与组织接触,只产生极低的温度将收集盖上的热传输膜溶解,使其产生粘性,和激光照射位置相对应的组织结合,达到细胞分离的目的(图一)。近红外激光技术最大程度的保护了生物大分子的完整性,只需要少量的细胞就可以完成下游的分析工作。由于近红外激光束直径从3μm到80μm可调,适合用于各种细胞的捕获,尤其在单个细胞或小面积细胞群落的分离方面具备紫外激光器无可比拟的优势。
2)全面性:由美国MDC(Molecular Devices)公司生产的Veritas和ArcturusXT全自动激光捕获显微分离系统,采用近红外激光捕获为主,固态低能量紫外激光(0-250mW)高速切割为辅的完美结合方式,具有无可比拟的灵活性。Veritas采用的紫外激光器能量只有普通紫外激光器的1/300,切割速度比其他的紫外方法快20倍,从而使生物组织接受激光的作用时间短,而且具有独特的Active Q-switched技术和良好的激光束特性 (激光直径<1μm) 保证了切割的精确性,对邻近组织的影响最小,适用于比较坚硬的组织和面积较大的细胞群落的分离。对于基因组学、蛋白质组学的研究工作以及活细胞的分离培养和染色体的文库建立方面,具备近红外和紫外双激光管的仪器将成为研究者的首选。
3)可靠性:相比其他激光显微切割的细胞收集系统,Veritas采用唯一通过了美国FDA QSR(Quality system regulation ,医疗器材品质系统规范)产品制造和管理认证的专利收集盖,可以一次性收集上万个细胞,使实验流程和结果值得信赖,并且收集方式简单,只需要抬高收集盖即可,与依靠重力下降方式收集或上弹方式收集细胞相比,保证了细胞收集的成功率以及细胞分离前后的形状和相对位置不发生改变,方便细胞来源追踪以及收集结果的确认,尤其是在收集不规则形状的组织细胞时的优势更为显著。
4)应用广泛:Veritas可应用于各种类型的组织制片形式,如冰冻切片、石蜡切片、细胞涂片、活细胞等,甚至保存多年的珍贵病理切片也可获得满意的捕获以及后续分析结果;捕获分离过程不受染色方式的限制,普通染色(如HE染色)、免疫组化染色等都可使用。
5)试验成本低:由于应用范围广泛,各种载玻片均可适用,在整个操作过程中唯一的消耗品就是收集盖,大大降低了实验成本。而且Veritas具有终生免维护的近红外激光器和使用寿命长达6年的紫外激光器,很大程度的节约了仪器的维护费用,有利于研究工作的开展。
6)全封闭设计:Veritas激光捕获系统是目前唯一的全封闭的操作系统,很好的防止了操作过程中对样本的污染问题,尤其在细胞捕获分离后的RNA分析方面更加必要。另外全封闭的设计也便于环境控制,对于采用免疫荧光等方式染色的样本,提供了方便的荧光样本观察环境,而不需要特殊的暗室环境(图二)。
7)全自动化:Veritas具备目前激光显微捕获分离系统中真正意义上的全自动操作,包括自动聚焦、自动载物台移动、自动进行收集盖的加载和移动、自动镜头转换、滤光镜转换、自动照明调节等。MDC公司开发的软件具有实时监视捕获分离过程、拍摄切片导航图、记忆和存储玻片上不同视野位置以方便定位和查找细胞、拍摄捕获分离前后以及收集盖上的图像并进行存档等强大功能。更值得一提的是软件具有自动识别(AutoScan)功能,根据细胞染色的深浅、荧光标记的颜色、细胞的大小以及形状等特征自动快速的在整张玻片范围内寻找目的细胞,在寻找大量目的细胞或分散于整张玻片内的极少量细胞方面,省时、省力。
LCM的应用
作为美国肿瘤基因组计划和国际蛋白质组计划的支撑技术,LCM技术广泛应用于肿瘤学,发育生物学,神经科学,非软性组织(骨,皮肤,软骨组织),植物学,炎症科学,心血管科学,糖尿病,法医学,分子生物学,蛋白质组学,功能基因组学,活细胞,亚细胞结构(染色体等)等,尤其对于临床功能基因组学和蛋白质组学有很重要的意义.
Veritas 参考图片
ArcturusXT参考图片
|